你知道流式細(xì)胞周期檢測(cè)的常見問(wèn)題有哪些嗎？讓我們一起來(lái)看看吧！

一、樣本制備注意事項(xiàng)

1.根據(jù)不同的檢測(cè)細(xì)胞調(diào)整合適的溫度、濕度、酸堿度等培養(yǎng)環(huán)境，注意一定要無(wú)菌的環(huán)境培養(yǎng)。

2.培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，以對(duì)數(shù)期處理為宜，避免細(xì)胞量過(guò)少導(dǎo)致收集細(xì)胞量不足或者細(xì)胞量過(guò)多導(dǎo)致細(xì)胞開始大量死亡造成的實(shí)驗(yàn)誤差。

3.流式檢測(cè)細(xì)胞周期上機(jī)檢測(cè)所需收集細(xì)胞量較多，收集細(xì)胞時(shí)盡量多收集一些

4.流式檢測(cè)對(duì)細(xì)胞離心，重懸次數(shù)較多，注意動(dòng)作輕緩，避免過(guò)多地?fù)p傷、弄破細(xì)胞。

5.本實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞離心，重懸次數(shù)較多，注意動(dòng)作輕緩，避免過(guò)多地?fù)p傷細(xì)胞。

6.細(xì)胞周期待測(cè)細(xì)胞盡量要獲得單個(gè)細(xì)胞，避免DNA的降解。

7.樣本最關(guān)鍵的就是減少碎片(EDTA/不可過(guò)度吹打/離心rpm)。PI既能與DNA結(jié)合，又能與RNA結(jié)合，所以要用RNase降解。PI質(zhì)量及RNase所加量很重要，建議用商品化試劑。

8.污染脫氧核糖核酸酶會(huì)降解DNA，故玻璃器皿和試劑要干凈滅菌。

9.染液等物質(zhì)有一定毒性，注意防護(hù)。

二、流式檢測(cè)時(shí)的注意事項(xiàng)

1.固定時(shí)必須預(yù)冷PBS重懸打入無(wú)水乙醇中，做到隨加隨混勻，避免細(xì)胞形成團(tuán)塊。

2.固定后細(xì)胞雖然可以保存較長(zhǎng)時(shí)間后再上機(jī)檢測(cè)，為避免不可控因素影響最好盡早上機(jī)檢測(cè)。

3.進(jìn)樣速度：一般檢測(cè)細(xì)胞濃度調(diào)整為2*10^5到2*10^6/ml，建議進(jìn)樣速度為低速。若峰形較寬、CV較大，可能就是進(jìn)樣速度太快。

4.儀器質(zhì)控定期做，檢查質(zhì)控微球的CV值，盡可能排除因機(jī)器設(shè)置引起的峰形加寬。

5.通過(guò)電壓脈沖信號(hào)的寬度、高度、面積等參數(shù)區(qū)別實(shí)體組織標(biāo)本中的粘連細(xì)胞群體，zui大程度的減少粘連細(xì)胞帶來(lái)的假陽(yáng)性結(jié)果。

6.選擇合適的細(xì)胞系，不同的細(xì)胞系由于細(xì)胞形態(tài)、直徑等不同，會(huì)對(duì)結(jié)果的美觀程度有一定的影響，筆者常用HeLa細(xì)胞系，峰形較細(xì)，周期各階段明顯區(qū)別，結(jié)果美觀。

7.建議選擇6孔板操作，細(xì)胞給藥密度在40%左右，給藥時(shí)間不一定要與蛋白印跡法給藥時(shí)間一致。這是由于蛋白印跡法檢測(cè)的是蛋白表達(dá)的變化，例如給藥10小時(shí)，蛋白上可見明顯變化趨勢(shì)，但10小時(shí)收樣時(shí)，孔內(nèi)細(xì)胞已經(jīng)明顯觀察到細(xì)胞漂浮凋亡，那對(duì)流式檢測(cè)的結(jié)果會(huì)有很大的影響。流式細(xì)胞術(shù)收樣時(shí)，盡量保證孔內(nèi)細(xì)胞還未漂浮。

8.收樣時(shí)，如果孔內(nèi)已經(jīng)有細(xì)胞漂浮，細(xì)胞上清懸浮液也要收集。建議選用胰酶消化，消化時(shí)間必須嚴(yán)格控制，及時(shí)終止消化，消化時(shí)間太久，容易對(duì)細(xì)胞造成損傷和死亡。

9.收集細(xì)胞時(shí)，離心機(jī)選用4℃，300-500g離心5分鐘，小心吸去上清。加入0.3 mL預(yù)冷的PBS，將管內(nèi)的細(xì)胞混勻后，再加入0.7 mL預(yù)冷的無(wú)水乙醇，4℃固定過(guò)夜。整個(gè)收樣過(guò)程中，不要用槍頭劇烈吹打細(xì)胞，一是會(huì)損傷細(xì)胞，二是造成細(xì)胞損失。

10.上機(jī)前，離心機(jī)選用4℃，300-500g離心5分鐘，棄去上清。此時(shí)格外需要注意的是由于不同時(shí)期細(xì)胞的重量不一樣，離心后細(xì)胞不是全部沉淀在管底，管壁上也會(huì)存在大量細(xì)胞，去上清一定要注意。加入100 μg/mL的PI染色液，避光染色15分鐘以上，上機(jī)測(cè)試前最好使用200目篩網(wǎng)過(guò)篩，以免細(xì)胞聚集堵塞機(jī)器管道。

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