質(zhì)粒是小的環(huán)狀超螺旋雙鏈 DNA，在宿主細胞內(nèi)獨立于染色體外自主復(fù)制并穩(wěn)定遺傳，可通過基因工程改造接入外源 DNA 作為基因載體，轉(zhuǎn)入宿主細胞。如今，質(zhì)粒已成為生物制藥領(lǐng)域中最重要的工具之一，可用于克隆，擴增和表達目的蛋白；也可用于病毒載體和 mRNA 的生產(chǎn)等領(lǐng)域。質(zhì)粒純化是大多數(shù)分子生物學(xué)實驗室的常用技術(shù)。雖然標(biāo)準(zhǔn)的堿裂解方法已經(jīng)很成熟，但仍然可能出現(xiàn)令人驚訝的問題。那么，你知道質(zhì)粒純化需要注意的要點有哪些呢?一起來探究一下吧！
忽略質(zhì)粒的拷貝數(shù)
同一大腸桿菌母株的質(zhì)粒產(chǎn)量可能因多種因素而有很大差異。然而，質(zhì)粒的復(fù)制起點將發(fā)揮重要作用，因為它將決定每個大腸桿菌細胞的質(zhì)?？截悢?shù)  。因此，根據(jù)質(zhì)粒的拷貝數(shù)，可能需要擴大質(zhì)粒制備規(guī)?；蜻M行多次質(zhì)粒制備，以獲得足夠的質(zhì)粒DNA供下游應(yīng)用使用。
忘記在培養(yǎng)物中添加抗生素
如果忘記在培養(yǎng)物中添加抗生素或添加太少，則可能導(dǎo)致質(zhì)粒丟失。確保仔細檢查培養(yǎng)物中抗生素的濃度。
忽略透氣重要性
大腸桿菌培養(yǎng)物通常在瓶中生長，需要適當(dāng)?shù)耐獠拍軐崿F(xiàn)最佳生長。通常需要以 200-250rpm的速度搖動培養(yǎng)物。此外，考慮通過最小培養(yǎng)物與空氣體積比約為 1:5 來增加培養(yǎng)物通氣，使用棉塞或透氧膜等確保培養(yǎng)物獲得足夠的通氣。
過量培養(yǎng)
另一種情況是越多并不是越好，如果培養(yǎng)生長時間過長會導(dǎo)致基因組DNA污染。最好在接種后約 12-18 小時處理細胞。
測量OD600
OD600是估算培養(yǎng)物密度的好方法，以便您知道何時處理細胞。由于高光密度無法測量，因此取一份培養(yǎng)物，稀釋十倍并使用標(biāo)準(zhǔn)分光光度計進行測量。培養(yǎng)物已準(zhǔn)備好以0.2-0.35的OD600處理十倍稀釋的培養(yǎng)物。
不要超出負載
許多質(zhì)粒制備試劑盒都附帶有關(guān)培養(yǎng)條件的建議。請仔細遵循這些步驟，以確保裂解純化柱不會過載。添加過多的培養(yǎng)物肯定會降低裂解物的質(zhì)量、堵塞純化柱并降低純化性能。
操作要清柔
正確純化質(zhì)粒的關(guān)鍵之一是將基因組DNA與質(zhì)粒DNA分離。可以通過移液或渦旋將細菌沉淀重懸于P1緩沖液中。然而，在裂解過程中不能過度混合，因為您可能會剪切基因組DNA，而基因組DNA會與柱基質(zhì)結(jié)合并污染您的質(zhì)粒。
忽略裂解時間
有些人可能認為裂解時間越長越好，然而大腸桿菌的堿裂解時間過長會產(chǎn)生大量非質(zhì)粒碎片。此外，不同菌株的大腸桿菌對堿裂解的敏感性也不同。最重要的是，裂解時間過長可能會導(dǎo)致質(zhì)粒 DNA 變性，從而導(dǎo)致制備質(zhì)量差。
wan全中和裂解物
添加中和溶液并與裂解液混合后，不要立即進行下一步！中和不wan全可能導(dǎo)致制備質(zhì)量差。確保多次翻轉(zhuǎn)試管以確保裂解物wan全中和。即使觀察到大的蓬松沉淀物，也需要多一點時間以確保溶液wan全混合。
防止細胞碎片雜質(zhì)
中和步驟后，許多質(zhì)粒制備物需要離心以將 DNA 與細胞碎片分離，從而澄清裂解物。在此步驟中，重要的是要緩慢進行，并避免將不必要的細胞碎片轉(zhuǎn)移到下一步，這可能會干擾結(jié)合和/或降低純度。
記得添加酒精
許多質(zhì)粒制備試劑盒包含使用乙醇的洗滌緩沖液。這些緩沖液通常為濃縮液，使用前必須用乙醇稀釋。這是一個常見的錯誤，經(jīng)常被遺忘并導(dǎo)致準(zhǔn)備失敗。另外，不要忘記確保擰緊蓋子以防止乙醇蒸發(fā)。
P2加熱緩沖液
下游轉(zhuǎn)化問題的一個常見原因是鹽和蛋白質(zhì)的污染。確保每次純化后測量A 260/A280和A260/A230比率，高于1.8的比率通常被認為是純凈且不含污染物的。
不要一次處理太多樣品
雖然可以最大限度地提高時間效率，但質(zhì)粒純化中的某些步驟對時間敏感。不要嘗試一次處理太多樣本，否則某些準(zhǔn)備工作可能會放置太久而失效。
不要忘記熱洗脫
如果質(zhì)粒>10 kb，請考慮使用加熱至50°C的洗脫緩沖液，以提高從柱基質(zhì)上洗脫的效率。此外，離心前可以將洗脫緩沖液留在柱上5-10分鐘。
以上就是小編總結(jié)的質(zhì)粒純化需要注意的要點，如果你有更多補充請聯(lián)系北京百奧創(chuàng)新科技有限公司客服！